夏宇尘教授课题组在乙肝病毒动物模型研究上再度突破

来源:亚博yabo888网页登录|官网|首页     发布时间 : 2022-06-21      点击量:

近日,武汉大学泰康医学院(基础医学院)医学病毒学研究所/病毒学国家重点实验室夏宇尘教授研究组在国际肝脏病学权威期刊《Hepatology》(IF=17.425)发表题为Limited disassembly of cytoplasmic hepatitis B virus nucleocapsids restricts viral infectionin murine hepatic cells的研究论文。该研究系统性地探究了乙型肝炎病毒(HBV)进入人和小鼠肝细胞后的过程,发现细胞质中HBV核衣壳的解离限制了病毒在小鼠肝细胞中的感染,为建立支持HBV感染的小鼠模型提供了分子基础。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒,主要感染人的肝细胞,其慢性感染可显著提高肝硬化和肝癌的发病率。据世界卫生组织报道,全球约有2.57亿人正遭受着HBV感染的困扰。中国是HBV感染的高发区,在新发人数下降的情况下,仍然有7千万感染者。针对慢性乙肝,目前临床上主要有干扰素α和核苷类似物两类药物。这些药物虽然可以有效抑制HBV的复制并减缓疾病进程,但不能彻底治愈慢性乙型肝炎,主要原因是现有药物无法清除HBV感染细胞后形成的微染色体cccDNA。由于缺少简便易操作的动物感染模型,HBV相关机制研究和药物研发受到了很大的阻碍。夏宇尘课题组前期建立了基于复制缺陷型AAV-HBV新型HBV cccDNA小鼠模型(Xu et al. CMGH, 2022),本研究聚焦于HBV不能在小鼠肝细胞中建立感染的原因。

早期研究显示小鼠作为最常用的小型实验动物并不支持HBV感染。将HBV受体人源牛磺胆酸钠共转移多肽(hNTCP)在小鼠肝细胞中表达可以支持HBV感染进入小鼠肝细胞,但仍不能成功建立HBV感染。为探究HBV在小鼠肝细胞中具体的受限制步骤,研究人员构建了hNTCP的转基因小鼠及稳定表达hNTCP的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6-hNTCP,可以支持HBV感染的人肝癌细胞系Huh7-hNTCP作为阳性对照。通过HBV/HDV(hepatitis delta virus,丁型肝炎病毒,HBV的卫星病毒,利用hNTCP感染肝细胞)感染及转染体外合成的pgRNA,首先证实了HBV可以利用hNTCP感染进入小鼠肝细胞,但不能形成cccDNA。同时,研究人员利用体外合成的cccDNA分子、工程菌中合成的重组cccDNA分子及HBV复制型质粒证实了HBV的转录可以在小鼠肝细胞中正常进行。为了研究HBV基因组rcDNA修复形成cccDNA的过程,研究人员在体外合成了rcDNA的不同修复中间体分子及从HBV病毒颗粒中抽提病毒来源的rcDNA分子,利用了rcDNA的体外修复体系及小鼠高压尾静脉注射模型,结果表明小鼠肝细胞可以支持rcDNA修复形成cccDNA。RcDNA修复形成cccDNA的场所是细胞核,因此研究人员利用核酸原位杂交技术探究小鼠细胞中rcDNA的入核过程是否受限,结果显示HBV基因组rcDNA可以被转运至小鼠肝细胞的细胞核。此结果在后续的Southern blotting实验中也得到了进一步验证。以上结果显示,小鼠肝细胞支持HBV基因组rcDNA的核转运及rcDNA分子修复形成cccDNA,这也提示HBV核衣壳的解离可能受到了限制。为验证这一假说,研究人员首先通过Southern blotting检测了HBV在小鼠肝细胞中感染不同时相的HBV不同类型DNA分子的存在及位置,发现非蛋白结合的rcDNA(protein-free rcDNA,PF-rcDNA,此类型rcDNA被认为是cccDNA合成的前体分子)可以在小鼠肝细胞核中检测到,但只短暂地存在于病毒感染的早期。进一步通过核酸酶敏感实验对HBV核衣壳完整性进行分析发现,小鼠肝细胞中无论是细胞质还是细胞核PF-rcDNA的核酸酶敏感性与人肝癌细胞系Huh7-hNTCP类似:绝大部分的细胞质及细胞核PF-rcDNA对核酸酶DNaseI处理敏感,少量PF-rcDNA耐受DNaseI的处理;与Huh7-hNTCP细胞不同的是,Hepa1-6-hNTCP细胞质中蛋白结合的rcDNA(protein-linked rcDNA,P-rcDNA,主要指HBV聚合酶蛋白Pol共价结合的rcDNA)表现出对DNaseI处理完全的耐受性,表明小鼠肝细胞质中的核衣壳解离受到限制。综上所述,本研究进一步揭示了小鼠肝细胞除了缺少病毒进入受体之外,在其细胞质中病毒核衣壳无法解离是限制HBV感染的一个重要原因,为建立支持HBV感染的小鼠模型提供了分子基础。

博士后赵凯涛为该论文第一作者,夏宇尘教授为通讯作者。夏宇尘教授2018年通过海外高层次人才计划回国后一直致力于病毒性肝炎的研究,作为通讯作者在Journal of Hepatology, Hepatology, Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology,Journal of Virology等学术期刊发表多篇论文。本研究工作得到国家自然科学基金(81971936,32100125)、吉利德亚洲肝病研究基金、中央高校基本科研业务费专项资金、湖北省医学青年拔尖人才、湖北省创新研究群体(2020CFA015)、湖北省卫健委创新群体(WJ2021C002)、中国博士后科学基金(2020M672419)等项目资助。

全文链接:https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/hep.32622

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